Soutenance de thèse de Johan REVOL-TISSOT

Les traitements antibiotiques sont un problème de santé publique qui s'est aggravé depuis que le développement des résistances est plus rapide que celui des nouveaux antimicrobiens. La propagation d'agents pathogènes résistants est l'une des préoccupations les plus pressantes pour la Santé Publique et la sécurité alimentaire. Des niveaux inquiétants dans le monde entier impliquent l'échec thérapeutique de grandes classes d'antibiotiques, en particulier dans les maladies bactériennes à Gram-négatif. La surexpression de l'efflux est l'un des principaux déclencheurs précoces de l’apparition de phénotypes de multirésistance (MDR). Cette tendance indique le besoin de développer des technologies qui permettent de déployer des dispositifs de diagnostic fournissant des tests de sensibilité aux antibiotiques (TSA) significatifs, rapides et peu invasifs dont les résultats influenceront la décision thérapeutique. Les mécanismes de résistance les plus fréquents utilisés par les bacilles à Gram-négatif consistent en l'inactivation enzymatique de l'antibiotique et les mutations de sa cible. Si ces mécanismes sont clairement mis en évidence par les TSA de routine, l'imperméabilité de la paroi cellulaire, qui donne lieu à une résistance naturelle mais aussi acquise en modifiant la structure ou la synthèse de transporteurs RND (Resistance Nodulation cell Division) n'est pas clairement identifiée. Ces systèmes induisent un haut niveau d'efflux qui devient donc la première ligne de défense bactérienne permettant au pathogène d'employer simultanément d'autres stratégies pour aux antibactériens mais aussi aux mécanismes de défense de l'hôte. Une approche pertinente consiste à rechercher de nouveaux dérivés de composés à haut signal fluorescent comme outil chimique répondant à l'expression de la résistance clinique par les pompes d'efflux. À partir d'une chimiothèque de produits naturels sélectionnés et grâce à la méthode d'accumulation spectrofluorimétrique développée dans notre laboratoire, nous avons pu identifier des pharmacophores intéressants pour la synthèse guidée de nouveaux dérivés. Pour cela, la concentration minimale inhibitrice et les mesures d'accumulation avec une forte intensité de fluorescence dans les bactéries ont été déterminées d’abord à partir de produits commerciaux puis de nouveaux dérivés synthétisés pour leur sensibilité à l’archétype de pompe AcrAB-TolC très répandu chez les entérobactéries d’intérêt comme Escherichia coli, Klebsiella aerogenes et Klebsiella pneumoniae exprimant plus ou moins les pompes d'efflux dans des conditions de perméabilité membranaire différentes. Après optimisation, une nouvelle série de dérivés a été sélectionnée pour ses propriétés fluorescentes sans effet cytotoxique sur la croissance des bactéries. Nous avons mesuré l'accumulation cellulaire des composés en fonction du rapport de concentration dans des souches délétées et celles productrices d'efflux à différents niveaux afin de déterminer la sensibilité à l'efflux. Les molécules hits sensibles à l'efflux présentent les meilleurs rapports d'accumulation, selon l'expression de la pompe, au moins quatre fois plus élevés que les fluoroquinolones contrôles. Nous avons démontré que ces dérivés ne présentaient pas de variation significative de l'influx pendant une courte période dans les souches délétées de porines. Enfin, ils possèdent une fluorescence linéaire à leur concentration sur une large gamme de concentration avec un niveau de prise en charge à l’équilibre court inférieur à 10 minutes, ce qui en fait un candidat intéressant en usage clinique récurrent. Ainsi, elles constituent une base solide pour la conception d'un outil diagnostic en temps réel permettant l'identification de l'accumulation d'antibiotiques comme test de sensibilité lié à l'apparition précoce de la résistance par efflux en clinique. Cet outil pourrait alors limiter l’impact des autres mécanismes de résistance mis en place lors d’un traitement antibiotique.

Antibiotic treatment is a public health problem that has become worse since resistance is developing faster than new antimicrobials. The spread of resistant pathogens is one of the most serious concerns for public health and food safety. Worrying levels worldwide imply therapeutic failure of major antibiotic classes, particularly in Gram-negative bacterial diseases. Overexpression of efflux is one of the major early triggers for the development of multidrug resistance phenotypes (MDR). This trend points to the need to develop technologies that enable technologies to deploy diagnostic devices that provide meaningful, rapid, and minimally invasive antibiotic susceptibility testing (AST) with results that will influence therapeutic decision-making. The most common resistance mechanisms used by Gram-negative bacilli consist of enzymatic inactivation of the antibiotic and mutations in the antibiotic target. While these mechanisms are clearly identified by routine AST, cell wall impermeability, which gives place to natural resistance but also acquired by modifying the structure or synthesis of RND (Resistance Nodulation cell Division) transporters is not clearly characterized. These systems induce a high level of efflux which therefore becomes the first bacterial defensive line allowing the pathogen to simultaneously employ other strategies to survive to antimicrobials but also host defense mechanisms. A relevant approach is to investigate novel derivatives of high fluorescent signaling compounds as a chemical tool responding to the expression of clinical resistance by efflux pumps. From a chemical library of selected natural products and thanks to the spectrofluorimetric accumulation method developed in our laboratory, we have been able to identify interesting pharmacophores for new derivative synthesis. For this purpose, the minimum inhibitory concentration and accumulation measurements with high fluorescence intensity in bacteria were determined first from commercial compounds and then from new derivatives synthesized for their sensitivity to the AcrAB-TolC pump archetype widespread in Enterobacteriaceae of interest such as Escherichia coli, Klebsiella aerogenes and Klebsiella pneumoniae expressing efflux pumps to a greater or lesser extent under different membrane permeability conditions. After optimization, a new set of derivatives was selected for their fluorescent properties without cytotoxic effect on bacterial growth. We measured the cellular accumulation of the compounds as a function of the concentration ratio in deletion and efflux-producing strains at different levels to determine efflux sensitivity. Efflux-sensitive hit compounds show the highest accumulation ratios, based on pump expression, at least four times higher than control fluoroquinolones. We demonstrated that these derivatives did not show significant variation in efflux over a short period of time in porin-deleted strains. Finally, they show concentration-related linear fluorescence over a wide concentration range with a sub-10 minute short steady-state uptake, making them an attractive candidate for recurrent clinical use. Thus, they provide a solid basis for the design of a real-time diagnostic tool for identifying antibiotic accumulation as a susceptibility test related to the early development of efflux resistance in the clinic. This new tool could then minimize other resistance mechanisms that may occur during antibiotic treatment.