Soutenance de thèse de Aurelie FERRAND

Résistance aux antibiotiques par efflux chez les Enterobacteriaceae multirésistantes : détection, prévalence et mise au point d’une technique permettant une utilisation à but diagnostic. Résumé : L'émergence des souches cliniques multirésistantes est un problème de santé publique dans la prise en charge et le traitement des infections associées. On assiste chez une souche à la co-existence de plusieurs mécanismes de résistance et l’efflux d’antibiotiques est souvent retrouvé en même temps que la résistance enzymatique et/ou les mutations des cibles. Les pompes d’efflux de type RND (Resistance Nodulation cell Division) avec AcrAB comme chef de file, sont les pompes majoritairement impliquées chez les entérobactéries. En routine au laboratoire, seules les résistances enzymatiques et les mutations de cible peuvent être identifiées. La mise au point d’un système de diagnostic permettant de confirmer la présence d’efflux pourrait être une aide dans l'amélioration de la prise en charge des patients infectés. L’état actuel de nos connaissances sur l’efflux chez les bactéries à Gram négatif et la régulation génétique de l’expression des pompes a été détaillé et discuté et a fait l’objet de 2 revues. Des souches cliniques d’Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, K. aerogenes, K. oxytoca, Enterobacter cloacae et Citrobacter koseri ont été utilisées dans notre étude. Des fluoroquinolones et le chloramphénicol ont été testés pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI) en présence ou non d’un inhibiteur des pompes, la phénylalanine arginine β -naphthylamide (PAẞN) à 20µg/mL. Le test semi-quantitatif de détection d’efflux a été optimisé sur des souches représentatives. L’enrofloxacine à une concentration de 3 µg/mL a été adoptée après plusieurs essais puis utilisée pour réaliser les tests d’accumulation intracellulaire chez les Entérobactéries intactes avec ou sans carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) à 20 µM. La lecture des résultats a été effectuée par spectrofluorimétrie après incubation à 25°C, une nuit. L’optimisation de la détermination par spectrofluorimétrie du niveau d’accumulation intracellulaire d’enrofloxacine nous a permis d’élaborer et proposer un mode opératoire reproductible pour la routine. La détermination d’un seuil de détection semi-quantitatif de l’efflux permet d’envisager l’application de ce test à visée diagnostique en laboratoire et de répondre à nos objectifs initiaux. Certaines souches ont été séquencées et les mutations retrouvées dans les régulateurs génétiques des effecteurs de la perméabilité membranaire montrent que : 1) certaines mutations sont devenues clonales et caractérisent l’empreinte génétique des souches d’aujourd’hui, 2) K. pneumoniae représente l’espèce qui présente le plus de mutations, ces dernières concernant avant tout les répresseurs des différents systèmes de régulation ou de pompes ainsi que le canal TolC. Mots clés : Entérobactéries, pompes d’efflux, multirésistance, souches cliniques, fluoroquinolones  

Resistance to antibiotics by efflux in multiresistant Enterobacteriaceae: detection, prevalence and development of a technique allowing use for diagnostic purposes. Summary : The emergence of multiresistant clinical strains is a public health problem in the management and treatment of associated infections. We observe in a strain the co-existence of several resistance mechanisms and the efflux of antibiotics is often found at the same time as the enzymatic resistance and/or the mutations of the targets. Efflux pumps of the RND (Resistance Nodulation cell Division) type, with AcrAB as the leader, are the pumps mainly involved in enterobacteriaceae. Routinely in the laboratory, only enzyme resistances and target mutations can be identified. The development of a diagnostic system to confirm the presence of efflux could help improve the management of infected patients. The current state of our knowledge on efflux in Gram-negative bacteria and the genetic regulation of pump expression has been detailed and discussed and has been the subject of 2 reviews. Clinical strains of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, K. aerogenes, K. oxytoca, Enterobacter cloacae and Citrobacter koseri were used in our study. Fluoroquinolones and chloramphenicol were tested to determine the minimum inhibitory concentrations (MIC) in the presence or absence of a pump inhibitor, phenylalanine arginine β -naphthylamide (PAẞN) at 20µg/mL. The semi-quantitative efflux detection test has been optimized on representative strains. Enrofloxacin at a concentration of 3 µg/mL was adopted after several trials and then used to perform intracellular accumulation tests in intact Enterobacteriaceae with or without carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) at 20 µM. The results were read by spectrofluorimetry after incubation at 25° C. overnight. The optimization of the determination by spectrofluorimetry of the level of intracellular accumulation of enrofloxacin has enabled us to develop and propose a reproducible procedure for routine use. The determination of a semi-quantitative detection threshold of the efflux makes it possible to consider the application of this test for diagnostic purposes in the laboratory and to meet our initial objectives. Some strains have been sequenced and the mutations found in the genetic regulators of membrane permeability effectors show that: 1) some mutations have become clonal and characterize the genetic fingerprint of today's strains, 2) K. pneumoniae represents the species which presents the most mutations, the latter concerning above all the repressors of the various regulatory systems or pumps as well as the TolC channel. Keywords: Enterobacteriaceae, efflux pumps, multidrug resistance, clinical strains, fluoroquinolones